植物細(xì)胞懸浮培養(yǎng)用培養(yǎng)搖床的實(shí)驗(yàn)方法
1.用鑷子夾取出生長(zhǎng)旺盛的松軟愈傷組織,放入三角瓶中并輕輕夾碎.每100ml三角瓶含滅過(guò)菌MS培養(yǎng)基10~15ml,每瓶接種1~1.5g愈傷組織,以保證zui初培養(yǎng)物中有足夠量的細(xì)胞.
2.將已接種的三角置于旋轉(zhuǎn)式搖床上.在100r/min,25~28℃條件下,進(jìn)行振蕩培養(yǎng).
3.經(jīng)6~10天培養(yǎng)后,若細(xì)胞明顯增殖,可向培養(yǎng)瓶中加新鮮培養(yǎng)基10ml,必要時(shí),可用大口移液管將培養(yǎng)物分裝成兩瓶,繼續(xù)培養(yǎng).（若細(xì)胞無(wú)明顯增殖,可能是起始材料不適當(dāng),應(yīng)考慮用旺盛增殖期的愈傷組織重新接種）.可進(jìn)行*次繼代培養(yǎng).
4.縣浮培養(yǎng)物的過(guò)濾：按“3”法繼代培養(yǎng)幾代后,培養(yǎng)液中應(yīng)主要由單細(xì)胞和小細(xì)胞團(tuán)（不多于20個(gè)細(xì)胞）組成.若仍含有效大的細(xì)胞團(tuán),可用適當(dāng)孔徑的金屬網(wǎng)篩過(guò)濾,再將過(guò)濾后的縣浮細(xì)胞繼續(xù)培養(yǎng).
5.細(xì)胞計(jì)算.取一定體積的細(xì)胞縣液,加入2倍體積的8%的三氧化鉻（CrO3）,置700C水浴處理15min.冷卻后,用移液管重復(fù)吹打細(xì)胞懸液,以使細(xì)胞充分分散,混勻后,取一滴縣液置入血細(xì)胞計(jì)數(shù)板上計(jì)數(shù).
6.制作細(xì)胞生長(zhǎng)曲線：為了解縣浮培養(yǎng)細(xì)胞的生長(zhǎng)動(dòng)態(tài),可用以下方法繪制生長(zhǎng)曲線圖：
（1）鮮重法（fresh weigh method）
在轉(zhuǎn)代培養(yǎng)的不同時(shí)間,取一定體積的懸浮細(xì)胞培養(yǎng)物,離心收集后,稱量細(xì)胞的鮮重,以鮮重為縱座標(biāo),培養(yǎng)時(shí)間為橫座標(biāo),繪制鮮重增長(zhǎng)曲線.
（2）干重法（dry weigh method ）
可在稱量鮮重之后,將細(xì)胞進(jìn)行曲烘干,再稱量干重.以干重為縱坐標(biāo),培養(yǎng)時(shí)間為橫坐標(biāo),繪制細(xì)胞干重生長(zhǎng)曲線.
上述兩種方法均需每隔2天取樣一次,共取7次,每個(gè)樣品重復(fù)三次,整個(gè)實(shí)驗(yàn)進(jìn)行期間不再往培養(yǎng)瓶中換入新鮮培養(yǎng)液.
7.細(xì)胞活力的檢查.對(duì)于初學(xué)者,往往需要檢測(cè)活細(xì)胞的比率.可在培養(yǎng)的不同階段,吸取一滴細(xì)胞縣液,放在載玻片上,滴一滴0.1%的酚藏花紅溶液（用培養(yǎng)基配制）染色,在顯微鏡下觀察.幾活細(xì)胞均不著色,而死細(xì)胞則很快被染成紅色.也可用0.1%熒光雙醋酸酯溶液染色,凡活細(xì)胞將在紫外光誘發(fā)下顯示藍(lán)絕色熒光,有經(jīng)驗(yàn)的操作者,則可根據(jù)細(xì)胞形態(tài),胞質(zhì)環(huán)流判別細(xì)胞的死活.
8.細(xì)胞再生能力的鑒定：為了解懸浮培養(yǎng)細(xì)胞是否仍具有再生能力,可將培養(yǎng)細(xì)胞轉(zhuǎn)移到瓊脂固化的培養(yǎng)基上,使基再形成愈傷組織,進(jìn)而在分化培養(yǎng)基上,誘導(dǎo)植株的分化.